靶向降解BRAF突變體V600E的PROTAC分子設(shè)計

RAF家族激酶是細胞增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，為EGFR或小GTP激酶 RAS的下游蛋白，常見的信號通路為RAS–RAF–MEK–ERK途徑。通常通過突變RAS或RAF使其功能激活，使得下游靶蛋白過度磷酸化，導(dǎo)致通路信號失調(diào)，最終引起癌癥的發(fā)生和發(fā)展。其中BRAF（V600E）是目前研究的重要靶點，臨床上使用dabrafenib，vemurafenib和encorafenib等靶向抑制劑治療相關(guān)疾病。雖然這些抑制劑顯示出了抗BRAF（V600E）驅(qū)動腫瘤的活性，但由于RAS和EGFR等成分仍然存在，后期依然會通過RAS-ERK途徑的信號促進腫瘤生長。此外，由于RAF蛋白容易二聚化，會導(dǎo)致這些藥物治療效果降低。因此，急需一類能克服這些問題的新藥。近期，加拿大多倫多大學(xué)的研究團隊通過開發(fā)靶向BRAF（V600E）的PROTAC分子，提出了一種新型抑制BRAF（V600E）驅(qū)動的癌癥治療的概念。

研究人員首先利用FDA已批準(zhǔn)的或者上在臨床前研究的BARF V600E的靶向抑制劑dabrafebib和BI 882370化合物與三種不同的E3泛素連接酶粘合劑（pomalidomide,thalidomide和VH023）進行排列組合以及中間連接片段長度和連接位點的篩選，最終確定了能夠靶向降解BARFV600E的P4B以及陰性Protac分子P4BMe。在對于BARF家族中的其他蛋白進行篩選發(fā)現(xiàn)，P4B能夠?qū)Ｒ恍越到釨ARF V600E蛋白，并且降低了源頭化合物BI 882370的脫靶效應(yīng)。

研究人員隨后利用黑色素瘤細胞A375(純和BARF V600E突變)確認(rèn)了P4B確實可以靶向降解 BRAF V600E蛋白，以及對下游ERK和MEK的磷酸化有顯著的抑制作用。并且通過利用MLN4924:類泛素化抑制劑；MG-132：蛋白酶體抑制劑；Pomalidomide：E3泛素連接酶粘合劑和蛋白泛素化檢測，證明了P4B通過給BRAF V600E蛋白標(biāo)記泛素化并通過蛋白酶體途徑進行降解。

研究人員橫向?qū)Ρ攘薖rotac陽性分子P4B，陰性分子P4BMe和源頭化合物BI 882370的作用效果，發(fā)現(xiàn)P4B在抑制細胞增殖和降低下游蛋白磷酸化方面更好。但在持續(xù)作用效果方面，P4B并不能長效抑制下游蛋白的磷酸化，相反BI 882370的有效作用時間更長。然而利用SPR技術(shù)分析這些化合物和蛋白的親和力并沒有顯著的差別。因此，化合物在效果作用時間差異方面可能存在別的機制。

研究人員在其他BRAF不同類型的細胞檢測了P4B的作用效果，發(fā)現(xiàn)在BRAF V600D和G466V突變體細胞中是有效的，尤其是在vemurafenib抗性細胞株A375-VR（其中一條染色體串聯(lián)突變）是有效的，說明P4B有望克服之前抑制劑耐藥問題。之前實驗的所有細胞系都是RAS WT型的細胞。臨床上的抑制劑都是可以激活RAS，并且將BRAF V600E由單體狀態(tài)轉(zhuǎn)化二聚體狀態(tài)，最終對這些抑制劑產(chǎn)生抗性。研究人員在將BRAF V600E細胞中的RAS敲出之后，P4B的功能不受影響.但RAS突變激活之后，P4B抑制細胞的增殖效果和降低下游蛋白的磷酸化效果都大大降低。因此，RAS的突變激活能夠使得細胞激活對P4B抵抗作用。

但P4B 在BRAF其他突變體以及野生型（WT）中是幾乎無效的。P4B抑制細胞的增殖效果和降低下游蛋白的磷酸化效果都大大降低。為了探究P4B在BRAF V600E和WT之間的區(qū)別，利用IP實驗發(fā)現(xiàn)P4B拉下蛋白中BRAF V600E多于BRAF WT。但在FP實驗中，卻發(fā)現(xiàn)P4B和E3泛素連接酶（CRBN）以及BRAF V600E/BRAFWT三元復(fù)合物的結(jié)合并沒有明顯差異。MEK可以結(jié)合BRAF以影響P4B的結(jié)合，當(dāng)體系中加入MEK以及突變體MEK（F311S），F(xiàn)P實驗證明P4B降解BRAF V600E和BRAFWT之間的差異是由于MEK的結(jié)合。

這項工作證明了PROTAC分子P4B能夠治療某些抗傳統(tǒng)抑制劑治療的BRAF突變驅(qū)動的細胞系的應(yīng)用前景，并且對于目前臨床上尚無藥物的BRAF串聯(lián)突變細胞系也是有一定效果，將來可以補充這方面的空白。另外，這項工作系統(tǒng)的闡明了P4B受MEK和BRAF WT相互作用傾向于降解BRAF V600E的作用機制，以及RAS的激活將BRAF V600E由單體狀態(tài)轉(zhuǎn)向二聚體狀態(tài)從而阻斷P4B的作用效果。未來如果利用中間連接片段或者新型E3泛素連接酶的粘合劑能夠?qū)RAF V600E固定在單體狀態(tài)，將大大拓展PROTAC分子P4B的作用范圍以及未來臨床應(yīng)用前景。

參考文獻

Posternak, G., Tang, X., Maisonneuve, P. etal. Functional characterization of a PROTAC directed against BRAFmutant V600E. Nat Chem Biol (2020).